Tankewol foar jo besite oan nature.com. De browserferzje dy't jo brûke hat beheinde CSS-stipe. Foar de bêste ûnderfining advisearje wy de lêste browserferzje te brûken (of de kompatibiliteitsmodus yn Internet Explorer út te skeakeljen). Derneist, om trochgeande stipe te garandearjen, sil dizze side frij wêze fan stilen en JavaScript.
Skeletspieren binne in heterogeen weefsel dat foaral bestiet út myofibrillen, dy't by minsken typysk yn trije typen wurde yndield: ien "stadich" (type 1) en twa "snelle" (typen 2A en 2X). Heterogeniteit tusken en binnen tradisjonele myofibriltypen bliuwt lykwols min begrepen. Wy hawwe transkriptomyske en proteomyske oanpakken tapast op respektivelik 1050 en 1038 yndividuele myofibrillen fan minsklike vastus lateralis. De proteomyske stúdzje omfette manlju, en de transkriptomyske stúdzje omfette 10 manlju en 2 froulju. Neist myosine swiere keten isoformen, hawwe wy metabolike proteïnen, ribosomale proteïnen en sellulêre junctionele proteïnen identifisearre as boarnen fan multidimensionale yntermyofibrilfariabiliteit. Fierder, nettsjinsteande de identifikaasje fan klusters fan stadige en snelle fezels, suggerearje ús gegevens dat type 2X fezels fenotypysk net te ûnderskieden binne fan oare snelle-twitch fezels. Fierder is de klassifikaasje basearre op myosine swiere keten net genôch om it myofiberfenotype yn nemaline myopathyen te beskriuwen. Oer it algemien suggerearje ús gegevens multidimensionale myofaser-heterogeniteit, mei boarnen fan fariaasje dy't fierder geane as myosine-swiere keten-isoformen.
Sellulêre heterogeniteit is in ynherint skaaimerk fan alle biologyske systemen, wêrtroch sellen spesjalisearje kinne om te foldwaan oan 'e ferskillende behoeften fan weefsels en sellen.1 De tradisjonele opfetting fan heterogeniteit fan skeletspiervezels is dat motorneuronen it fezeltype binnen in motorienheid definiearje, en dat fezeltype (d.w.s. type 1, type 2A, en type 2X by minsken) wurdt bepaald troch de skaaimerken fan myosine swiere keten (MYH) isoformen.2 Dit wie yn earste ynstânsje basearre op har pH ATPase-ynstabiliteit,3,4 en letter op har molekulêre ekspresje fan MYH.5 Mei de identifikaasje en lettere akseptaasje fan "mingde" fezels dy't meardere MYH's yn ferskillende proporsjes mei-ekspressearje, wurde skeletspiervezels lykwols hieltyd mear sjoen as in kontinuüm ynstee fan as ûnderskate fezeltypen.6 Nettsjinsteande dit fertrout it fjild noch altyd sterk op MYH as de primêre klassifikator foar myofezelklassifikaasje, in opfetting dy't wierskynlik beynfloede wurdt troch de beheiningen en wichtige foaroardielen fan iere knaagdierstúdzjes waans MYH-ekspresjeprofilen en berik fan fezeltypen ferskille fan dy by minsken.2 De situaasje wurdt fierder yngewikkelder makke troch it feit dat ferskate minsklike skeletspieren in ferskaat oanbod fan fezeltypen sjen litte.7 De vastus lateralis is in mingde spier mei in tuskenlizzende (en dêrom represintative) MYH-ekspresjeprofyl.7 Fierder makket syn gemak fan sampling it de bêst bestudearre spier by minsken.
Dêrom is ûnpartidige ûndersyk nei de ferskaat oan skeletspiervezels mei krêftige "omics"-ark kritysk, mar ek útdaagjend, foar in part fanwegen de mearkearnige aard fan skeletspiervezels. Transcriptomics8,9 en proteomics10 technologyen hawwe lykwols de lêste jierren in revolúsje yn gefoelichheid ûndergien fanwegen ferskate technologyske foarútgong, wêrtroch't skeletspieren mei resolúsje fan ien glêstried analysearre wurde kinne. As gefolch is wichtige foarútgong boekt yn it karakterisearjen fan de ferskaat oan ien glêstried en harren reaksje op atrofyske stimuli en ferâldering11,12,13,14,15,16,17,18. Wichtich is dat dizze technologyske foarútgong klinyske tapassingen hawwe, wêrtroch't sykte-assosjeare dysregulaasje detaillearre en presys karakterisearre wurde kin. Bygelyks, de patofysiology fan nemaline myopaty, ien fan 'e meast foarkommende erflike spiersykten (MIM 605355 en MIM 161800), is kompleks en betiizjend.19,20 Dêrom kin in bettere karakterisaasje fan 'e dysregulaasje fan skeletspiervezels liede ta wichtige foarútgong yn ús begryp fan dizze sykte.
Wy hawwe metoaden ûntwikkele foar transkriptomyske en proteomyske analyze fan ienkele skeletspiervezels dy't mei de hân isolearre binne út minsklike biopsie-eksimplaren en se tapast hawwe op tûzenen fezels, wêrtroch't wy de sellulêre heterogeniteit fan minsklike skeletspiervezels ûndersykje koene. Yn 'e rin fan dit wurk hawwe wy de krêft fan transkriptomyske en proteomyske fenotyping fan spiervezels demonstrearre en metabolike, ribosomale en sellulêre junctionele aaiwiten identifisearre as wichtige boarnen fan yntervezelfariabiliteit. Fierder hawwe wy mei dizze proteomyske workflow de klinyske relevânsje fan nematodemyopaty yn ienkele skeletspiervezels karakterisearre, wêrby't in koördinearre ferskowing nei net-oksidative fezels iepenbiere waard, ûnôfhinklik fan it fezeltype, basearre op MYH.
Om de heterogeniteit fan minsklike skeletspiervezels te ûndersykjen, hawwe wy twa workflows ûntwikkele om transkriptoom- en proteoomanalyse fan ienkele skeletspiervezels mooglik te meitsjen (figuer 1A en oanfoljende figuer 1A). Wy hawwe ferskate metodologyske stappen ûntwikkele en optimalisearre, fan stekproefopslach en behâld fan RNA- en proteïne-yntegriteit oant it optimalisearjen fan de trochfier foar elke oanpak. Foar transkriptoomanalyse waard dit berikt troch stekproefspesifike molekulêre barcodes yn te foegjen by de earste stap fan reverse transkripsje, wêrtroch't 96 fezels koene wurde gearfoege foar effisjinte downstream-ferwurking. Djippere sekwinsjearring (± 1 miljoen lêzingen per fezel) yn ferliking mei tradisjonele iensellige oanpakken ferrike de transkriptoomgegevens fierder. 21 Foar proteomika brûkten wy in koarte chromatografyske gradiënt (21 minuten) kombineare mei DIA-PASEF-gegevensakwisysje op in timsTOF-massaspektrometer om de proteoomdjipte te optimalisearjen, wylst in hege trochfier behâlden waard. 22,23 Om de heterogeniteit fan sûne skeletspiervezels te ûndersykjen, hawwe wy de transkriptomen fan 1.050 yndividuele fezels fan 14 sûne folwoeksen donors en de proteomen fan 1.038 fezels fan 5 sûne folwoeksen donors karakterisearre (Oanfoljende Tabel 1). Yn dit artikel wurde dizze datasets oantsjut as respektivelik de transkriptomen en proteomen fan 1.000 fezels. Us oanpak detektearre yn totaal 27.237 transkripten en 2.983 proteïnen yn 'e transkriptomyske en proteomyske analyses fan 1.000 fezels (Ofbylding 1A, Oanfoljende Datasets 1-2). Nei it filterjen fan 'e transkriptomyske en proteomyske datasets foar >1.000 detektearre genen en 50% jildige wearden per fezel, waarden folgjende bioinformatyske analyses útfierd foar respektivelik 925 en 974 fezels yn it transkriptoom en proteoom. Nei filterjen waarden in gemiddelde fan 4257 ± 1557 genen en 2015 ± 234 proteïnen (gemiddelde ± SD) per fezels ûntdutsen, mei beheinde ynter-yndividuele fariabiliteit (Oanfoljende figueren 1B-C, Oanfoljende datasets 3-4). De fariabiliteit binnen de dielnimmers wie lykwols mear útsprutsen by de dielnimmers, wierskynlik fanwegen ferskillen yn RNA/proteïne-opbringst tusken fezels fan ferskillende lingten en dwersdoorsnede-oerflakken. Foar de measte proteïnen (>2000) wie de koëffisjint fan fariaasje ûnder 20% (Oanfoljende figuer 1D). Beide metoaden makken it mooglik om in breed dynamysk berik fan transkripten en proteïnen te fangen mei heech útdrukte sinjaturen dy't wichtich binne foar spierkontraksje (bygelyks ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Oanfoljende figueren 1E-F). De measte fan 'e identifisearre funksjes wiene mienskiplik tusken de transkriptomyske en proteomyske datasets (Oanfoljende figuer 1G), en de gemiddelde UMI/LFQ-yntensiteiten fan dizze funksjes wiene ridlik goed korrelearre (r = 0.52) (Oanfoljende figuer 1H).
Transkriptomika- en proteomika-workflow (makke mei BioRender.com). BD Dynamyske berikkrommen foar MYH7, MYH2, en MYH1, en berekkene drompelwearden foar fezelstype-tawizing. E, F Ferdieling fan MYH-ekspresje oer fezels yn transkriptomika- en proteomika-datasets. G, H Uniform Diversity Approximation and Projection (UMAP) plots foar transkriptomika en proteomika kleurd troch MYH-basearre fezelstype. I, J Feature plots dy't MYH7-, MYH2- en MYH1-ekspresje sjen litte yn transkriptomika- en proteomika-datasets.
Wy hawwe yn earste ynstânsje úteinset om MYH-basearre fezelstype ta te wizen oan elke fezel mei in optimalisearre oanpak dy't gebrûk makket fan 'e hege gefoelichheid en dynamyske berik fan MYH-ekspresje yn omics-datasets. Eardere stúdzjes hawwe willekeurige drompelwearden brûkt om fezels te labeljen as suver type 1, type 2A, type 2X, of mingd basearre op in fêst persintaazje ekspresje fan ferskate MYH's11,14,24. Wy hawwe in oare oanpak brûkt wêrby't de ekspresje fan elke fezel waard rangearre troch de MYH's dy't wy brûkten om de fezels te typen: MYH7, MYH2, en MYH1, dy't oerienkomme mei type 1, type 2A, en type 2X fezels, respektivelik. Wy hawwe doe wiskundich it legere ynfleksjepunt fan elke resultearjende kromme berekkene en it brûkt as in drompelwearde om fezels ta te wizen as posityf (boppe de drompelwearde) of negatyf (ûnder de drompelwearde) foar elke MYH (figuer 1B-D). Dizze gegevens litte sjen dat MYH7 (figuer 1B) en MYH2 (figuer 1C) mear ûnderskate oan/út-ekspresjeprofilen hawwe op RNA-nivo yn ferliking mei proteïnenivo. Yndied, op proteïnenivo ekspressearren mar in pear fezels gjin MYH7, en gjin fezel hie 100% MYH2-ekspresje. Wy brûkten dêrnei foarôf bepaalde ekspresjedrompelwearden om MYH-basearre fezeltypen ta te wizen oan alle fezels yn elke dataset. Bygelyks, MYH7+/MYH2-/MYH1- fezels waarden tawiisd oan type 1, wylst MYH7-/MYH2+/MYH1+ fezels waarden tawiisd oan mingd type 2A/2X (sjoch Oanfoljende Tabel 2 foar in folsleine beskriuwing). By it gearfoegjen fan alle fezels seagen wy in opmerklik ferlykbere ferdieling fan MYH-basearre fezeltypen op sawol RNA- (figuer 1E) as proteïne- (figuer 1F) nivo's, wylst de relative gearstalling fan MYH-basearre fezeltypen farieare tusken yndividuen, lykas ferwachte (Oanfoljende Figuer 2A). De measte fezels waarden klassifisearre as suver type 1 (34–35%) of type 2A (36–38%), hoewol in signifikant oantal mingde type 2A/2X-fezels ek waarden ûntdutsen (16–19%). In opfallend ferskil is dat suvere type 2X-fezels allinich op RNA-nivo detektearre wurde koene, mar net op proteïnenivo, wat suggerearret dat rappe MYH-ekspresje teminsten foar in part post-transkripsjoneel regele wurdt.
Wy hawwe ús op proteomika basearre MYH-fezeltyperingsmetoade validearre mei help fan antistoffen-basearre dot blotting, en beide metoaden berikten 100% oerienkomst yn it identifisearjen fan suvere type 1- en type 2A-fezels (sjoch Oanfoljende Figuer 2B). De op proteomika basearre oanpak wie lykwols gefoeliger, effisjinter yn it identifisearjen fan mingde fezels, en it kwantifisearjen fan it oandiel fan elk MYH-gen yn elke fezel. Dizze gegevens demonstrearje de effektiviteit fan it brûken fan in objektive, tige gefoelige op omika basearre oanpak om skeletspierfezeltypen te karakterisearjen.
Wy brûkten doe de kombineare ynformaasje levere troch transkriptomika en proteomika om myofibers objektyf te klassifisearjen op basis fan har folsleine transkriptoom of proteoom. Mei de unifoarme manifold benadering en projeksje (UMAP) metoade om de dimensjonaliteit te ferminderjen ta seis haadkomponinten (Oanfoljende figueren 3A-B), koene wy myofiberfariabiliteit yn it transkriptoom (Oanfoljende figueren 1G) en proteoom (Oanfoljende figueren 1H) visualisearje. It is opmerklik dat myofibers net groepearre waarden troch dielnimmers (Oanfoljende figueren 3C-D) of testdagen (Oanfoljende figuer 3E) yn sawol de transkriptomika- as proteomika-datasets, wat suggerearret dat de fariabiliteit binnen in persoan yn skeletspiervezels heger is as de fariabiliteit tusken persoanen. Yn 'e UMAP-plot ûntstiene twa ûnderskate klusters dy't "snelle" en "stadige" myofibers fertsjintwurdigje (Figuren 1G-H). MYH7+ (stadige) myofibers wiene klustere by de positive poal fan UMAP1, wylst MYH2+ en MYH1+ (snelle) myofibers wiene klustere by de negative poal fan UMAP1 (Ofbyldings 1I–J). Der waard lykwols gjin ûnderskied makke tusken snelle-twitch-fezeltypen (d.w.s. type 2A, type 2X, of mingde 2A/2X) basearre op MYH-ekspresje, wat suggerearret dat MYH1 (Ofbylding 1I–J) of oare klassike 2X myofibermarkers lykas ACTN3 of MYLK2 (Oanfoljende Figueren 4A–B) ekspresje gjin ûnderskied makket tusken ferskate myofibertypen by it beskôgjen fan it heule transkriptoom of proteoom. Boppedat, yn ferliking mei MYH2 en MYH7, wiene pear transkripten of proteïnen posityf korreleare mei MYH1 (Oanfoljende Figs. 4C–H), wat suggerearret dat de oerfloed fan MYH1 it myofiber-transkriptoom/proteoom net folslein reflektearret. Ferlykbere konklúzjes waarden berikt by it beoardieljen fan 'e mingde ekspresje fan' e trije MYH-isoformen op UMAP-nivo (Oanfoljende Fig. 4I-J). Sadwaande, wylst 2X-vezels allinich op transkriptnivo identifisearre wurde kinne op basis fan MYH-kwantifikaasje, binne MYH1+-vezels net te ûnderskieden fan oare snelle fezels as it heule transkriptoom of proteoom beskôge wurdt.
As in earste ferkenning fan heterogeniteit fan stadige fezels bûten MYH, hawwe wy fjouwer fêststelde spesifike proteïnen foar stadige fezels beoardiele: TPM3, TNNT1, MYL3, en ATP2A22. Subtypen fan stadige fezels lieten hege, hoewol net perfekte, Pearson-korrelaasjes sjen mei MYH7 yn sawol transkriptomika (Oanfoljende figuer 5A) as proteomika (Oanfoljende figuer 5B). Likernôch 25% en 33% fan 'e stadige fezels waarden net klassifisearre as suvere stadige fezels troch alle gen/proteïnesubtypen yn transkriptomika (Oanfoljende figuer 5C) en proteomika (Oanfoljende figuer 5D), respektivelik. Dêrom yntrodusearret de klassifikaasje fan stadige fezels basearre op meardere gen/proteïnesubtypen ekstra kompleksiteit, sels foar proteïnen dy't bekend binne as spesifyk foar fezels. Dit suggerearret dat de klassifikaasje fan fezels basearre op isoformen fan in inkele gen/proteïnefamylje de wiere heterogeniteit fan skeletspierfezels miskien net genôch reflektearret.
Om de fenotypyske fariabiliteit fan minsklike skeletspiervezels fierder te ûndersiikjen op 'e skaal fan it heule omics-model, hawwe wy ûnpartidige dimensjonaliteitsreduksje fan 'e gegevens útfierd mei help fan haadkomponintanalyse (PCA) (figuer 2A). Lykas by UMAP-plots beynfloede noch de dielnimmer noch de testdei de klustering fan fezels op PCA-nivo (Oanfoljende figueren 6A-C). Yn beide datasets waard it MYH-basearre fezeltype ferklearre troch PC2, dat in kluster fan stadich-twitch type 1-fezels en in twadde kluster mei snelle-twitch type 2A, type 2X en mingde 2A/2X-fezels sjen liet (figuer 2A). Yn beide datasets wiene dizze twa klusters ferbûn troch in lyts oantal mingde type 1/2A-fezels. Lykas ferwachte befêstige oerrepresintaasje-analyze fan 'e wichtichste PC-driuwfearren dat PC2 waard oandreaun troch kontraktile en metabolike sinjaturen (figuer 2B en oanfoljende figueren 6D-E, oanfoljende datasets 5-6). Oer it algemien waard fûn dat it op MYH basearre fezelstype genôch wie om trochgeande fariaasje lâns PC2 te ferklearjen, mei útsûndering fan saneamde 2X-fezels dy't ferspraat wiene oer it transkriptoom binnen it snelle kluster.
A. Haadkomponintanalyse (PCA) plots fan transkriptome- en proteome-datasets kleurd neffens fezeltype basearre op MYH. B. Ferrikingsanalyse fan transkriptome- en proteïne-driuwfearren yn PC2 en PC1. Statistyske analyze waard útfierd mei it clusterProfiler-pakket en Benjamini-Hochberg-oanpaste p-wearden. C, D. PCA-plots kleurd neffens ynterzellulêre adhesiongenontology (GO) termen yn 'e transkriptome- en kostamere GO-termen yn it proteome. Pylken fertsjintwurdigje transkriptome- en proteïne-driuwfearren en harren rjochtingen. E, F. Uniforme manifold benadering en projeksje (UMAP) plots fan klinysk relevante funksjes dy't ekspresjegradiënten sjen litte ûnôfhinklik fan stadich/snel fezeltype. G, H. Korrelaasjes tusken PC2- en PC1-driuwfearren yn transkriptomes en proteomes.
Unferwachts ferklearre it op MYH basearre myofibertype allinich de twadde heechste mjitte fan fariabiliteit (PC2), wat suggerearret dat oare biologyske faktoaren dy't net relatearre binne oan it op MYH basearre myofibertype (PC1) in wichtige rol spylje by it regeljen fan heterogeniteit fan skeletspierfezels. Oerrepresintaasje-analyze fan 'e wichtichste driuwfearren yn PC1 liet sjen dat fariabiliteit yn PC1 primêr bepaald waard troch sel-sel-adhesie en ribosoomynhâld yn it transkriptoom, en kostameren en ribosomale aaiwiten yn it proteoom (figuer 2B en oanfoljende figuren 6D-E, oanfoljende dataset 7). Yn skeletspieren ferbine kostameren de Z-skiif mei it sarkolemma en binne se belutsen by krêftoerdracht en sinjalearring. 25 Annotearre PCA-plots mei sel-sel-adhesie (transkriptoom, figuer 2C) en kostameer (proteoom, figuer 2D) funksjes lieten in sterke ferskowing nei lofts sjen yn PC1, wat oanjout dat dizze funksjes ferrike binne yn bepaalde fezels.
In detaillearre ûndersyk fan myofiber-klustering op UMAP-nivo liet sjen dat de measte funksjes in myofiber-type-ûnôfhinklike MYH-basearre ekspresjegradiënt sjen lieten ynstee fan myofiber-subkluster-spesifyk. Dizze kontinuïteit waard waarnommen foar ferskate genen dy't assosjeare binne mei patologyske omstannichheden (figuer 2E), lykas CHCHD10 (neuromuskulêre sykte), SLIT3 (spieratrofy), CTDNEP1 (spiersykte). Dizze kontinuïteit waard ek waarnommen oer it proteoom, ynklusyf proteïnen dy't assosjeare binne mei neurologyske steurnissen (UGDH), insulinesignalisaasje (PHIP), en transkripsje (HIST1H2AB) (figuer 2F). Kollektyf jouwe dizze gegevens kontinuïteit oan yn fezeltype-ûnôfhinklike stadige/snelle twitch-heterogeniteit oer ferskate myofibers.
Nijsgjirrich is dat bestjoerdergenen yn PC2 in goede transkriptome-proteome-korrelaasje lieten sjen (r = 0.663) (figuer 2G), wat suggerearret dat stadich- en fluch-trekkende fezels, en yn it bysûnder de kontraktile en metabolike eigenskippen fan skeletspiervezels, transkripsjoneel regele wurde. Bestjoerdergenen yn PC1 lieten lykwols gjin transkriptome-proteome-korrelaasje sjen (r = -0.027) (figuer 2H), wat suggerearret dat fariaasjes dy't net relatearre binne oan stadich/snel-trekkende fezels, foar in grut part nei transkripsje regele wurde. Omdat fariaasjes yn PC1 primêr ferklearre waarden troch ribosomale genontologytermen, en sjoen dat ribosomen in krúsjale en spesjalisearre rol spylje yn 'e sel troch aktyf diel te nimmen oan en proteïne-oersetting te beynfloedzjen,31 hawwe wy ús folgjende rjochte op it ûndersykjen fan dizze ûnferwachte ribosomale heterogeniteit.
Wy hawwe earst de plot fan 'e proteomics-haadkomponintanalyse kleurd neffens de relative oerfloed fan proteïnen yn 'e GOCC-term "cytoplasmatysk ribosoom" (figuer 3A). Hoewol dizze term ferrike is oan 'e positive kant fan PC1, wat resulteart yn in lytse gradiënt, ribosomale proteïnen de partysje yn beide rjochtingen fan PC1 oandriuwe (figuer 3A). Ribosomale proteïnen ferrike oan 'e negative kant fan PC1 omfette RPL18, RPS18 en RPS13 (figuer 3B), wylst RPL31, RPL35 en RPL38 (figuer 3C) de wichtichste driuwfearren wiene oan 'e positive kant fan PC1. Nijsgjirrich is dat RPL38 en RPS13 heech útdrukt waarden yn skeletspieren yn ferliking mei oare weefsels (oanfoljende figuer 7A). Dizze ûnderskiedende ribosomale sinjaturen yn PC1 waarden net waarnommen yn it transkriptoom (oanfoljende figuer 7B), wat oanjout op post-transkripsjonele regeling.
A. Haadkomponintanalyse (PCA) plot kleurd neffens cytoplasmatyske ribosomale genontology (GO) termen oer it proteoom. Pylken jouwe de rjochting oan fan proteïne-bemiddelde fariaasje yn 'e PCA-plot. Linelengte komt oerien mei de haadkomponintskoare foar in bepaald proteïne. B, C. PCA-funksjeplots foar RPS13 en RPL38. D. Unsupervised hiërargyske klusteranalyse fan cytoplasmatyske ribosomale proteïnen. E. Struktureel model fan it 80S ribosoom (PDB: 4V6X) dat ribosomale proteïnen mei ferskillende oerfloed yn skeletspiervezels markearret. F. Ribosomale proteïnen mei ferskillende stoichiometry lokalisearre tichtby it mRNA-útgongskanaal.
De konsepten fan ribosomale heterogeniteit en spesjalisaasje binne earder foarsteld, wêrby't de oanwêzigens fan ûnderskate ribosomale subpopulaasjes (ribosomale heterogeniteit) direkt ynfloed kin hawwe op proteïne-oersetting yn ferskate weefsels32 en sellen33 troch de selektive oersetting fan spesifike mRNA-transkriptpools34 (ribosomale spesjalisaasje). Om subpopulaasjes fan ribosomale proteïnen te identifisearjen dy't mei-ekspressearre wurde yn skeletspiervezels, hawwe wy in net-begeliede hiërargyske klusteranalyse útfierd fan ribosomale proteïnen yn it proteoom (Ofbylding 3D, Oanfoljende Dataset 8). Lykas ferwachte, klusteren ribosomale proteïnen net op fezeltype basearre op MYH. Wy identifisearren lykwols trije ûnderskate klusters fan ribosomale proteïnen; it earste kluster (ribosomaal_kluster_1) wurdt ko-regulearre mei RPL38 en hat dêrom ferhege ekspresje yn fezels mei in posityf PC1-profyl. It twadde kluster (ribosomaal_kluster_2) wurdt ko-regulearre mei RPS13 en is ferhege yn fezels mei in negatyf PC1-profyl. De tredde kluster (ribosomaal_kluster_3) lit gjin koördinearre ferskillende ekspresje sjen yn skeletspiervezels en kin beskôge wurde as it "kearn" skeletspierribosomale proteïne. Sawol ribosomale klusters 1 as 2 befetsje ribosomale proteïnen dy't earder oantoand binne dat se alternative oersetting regelje (bygelyks RPL10A, RPL38, RPS19, en RPS25) en funksjoneel ynfloed hawwe op ûntwikkeling (bygelyks RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 Yn oerienstimming mei de PCA-resultaten liet de waarnommen heterogene fertsjintwurdiging fan dizze ribosomale proteïnen oer fezels ek kontinuïteit sjen (Oanfoljende figuer 7C).
Om de lokaasje fan heterogene ribosomale proteïnen binnen it ribosoom te visualisearjen, hawwe wy in struktureel model fan it minsklike 80S ribosoom brûkt (Protein Data Bank: 4V6X) (figuer 3E). Nei it isolearjen fan ribosomale proteïnen dy't ta ferskate ribosomale klusters hearden, wiene har lokaasjes net nau op elkoar ôfstimd, wat suggerearret dat ús oanpak gjin ferriking levere foar bepaalde regio's/fraksjes fan it ribosoom. Nijsgjirrich is lykwols dat it oandiel fan grutte subunitproteïnen yn kluster 2 leger wie as yn klusters 1 en 3 (Oanfoljende figuer 7D). Wy seagen dat proteïnen mei feroare stoichiometry yn skeletspiervezels foaral lokalisearre wiene oan it ribosoomoerflak (figuer 3E), yn oerienstimming mei har fermogen om te ynteraksje mei ynterne ribosoomyngongsplak (IRES) eleminten yn ferskate mRNA-populaasjes, wêrtroch selektive oersetting koördinearre waard. 40, 41 Fierder wiene in protte proteïnen mei feroare stoichiometry yn skeletspiervezels lizzend tichtby funksjonele regio's lykas de mRNA-útgongstunnel (figuer 3F), dy't selektyf translaasje-elongaasje en arrestaasje fan spesifike peptiden regelje. 42 Gearfetsjend suggerearje ús gegevens dat de stoichiometry fan skeletspierribosomale aaiwiten heterogeniteit sjen lit, wat resulteart yn ferskillen tusken skeletspiervezels.
Wy hawwe dêrnei úteinset om de hantekeningen fan snelle en stadich-trekkende fezels te identifisearjen en de meganismen fan har transkripsjonele regeling te ûndersiikjen. By it fergelykjen fan 'e klusters fan snelle en stadich-trekkende fezels definieare troch UMAP yn 'e twa datasets (Figuren 1G-H en 4A-B), identifisearren transkriptomyske en proteomyske analyses respektivelik 1366 en 804 ferskillend oerfloedige funksjes (Figuren 4A-B, Oanfoljende Datasets 9-12). Wy observearren de ferwachte ferskillen yn hantekeningen relatearre oan sarkomeren (bygelyks, tropomyosine en troponine), eksitaasje-kontraksjekoppeling (SERCA-isoformen), en enerzjymetabolisme (bygelyks, ALDOA en CKB). Boppedat waarden transkripten en proteïnen dy't proteïne-ubiquitinaasje regelje, ferskillend útdrukt yn snelle en stadich-trekkende fezels (bygelyks, USP54, SH3RF2, USP28, en USP48) (Figuren 4A-B). Boppedat wie it mikrobiale proteïnegen RP11-451G4.2 (DWORF), dat earder oantoand is dat it ferskillend útdrukt wurdt oer laamspiervezeltypen43 en SERCA-aktiviteit yn hertspier44 ferbetteret, signifikant opregulearre yn stadige skeletspiervezels (Ofbylding 4A). Op deselde wize waarden op it nivo fan yndividuele fezels wichtige ferskillen waarnommen yn bekende sinjaturen lykas metabolisme-relatearre laktaatdehydrogenase-isoformen (LDHA en LDHB, Figuer 4C en Oanfoljende Figuer 8A)45,46, lykas earder ûnbekende spesifike sinjaturen foar it fezeltype (lykas IRX3, USP54, USP28, en DPYSL3) (Ofbylding 4C). Der wie in wichtige oerlaap fan ferskillend útdrukte funksjes tusken de transkriptomyske en proteomyske datasets (Oanfoljende Figuer 8B), lykas in korrelaasje fan foldferoaring dy't benammen oandreaun waard troch de mear útsprutsen ferskillende ekspresje fan sarkomeerfunksjes (Oanfoljende Figuer 8C). It is opmerklik dat guon hantekeningen (bygelyks USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) allinich sterke post-transkripsjonele regeling op proteomysk nivo lieten sjen en hiene stadige/snelle twitch-fezeltypespesifike ekspresjeprofilen (Oanfoljende figuer 8C).
A en B fulkaanplots dy't stadige en snelle klusters fergelykje, identifisearre troch de unifoarme manifold benadering en projeksje (UMAP) plots yn figueren 1G-H. Kleurde stippen fertsjintwurdigje transkripten of proteïnen dy't signifikant ferskillend binne by FDR < 0.05, en tsjusterdere stippen fertsjintwurdigje transkripten of proteïnen dy't signifikant ferskillend binne by log feroaring > 1. Twa-wei statistyske analyze waard útfierd mei de DESeq2 Wald-test mei Benjamini-Hochberg oanpaste p-wearden (transkriptomika) of de Limma lineêre modelmetoade mei empiryske Bayesiaanske analyze folge troch Benjamini-Hochberg-oanpassing foar meardere fergelikingen (proteomika). C Hantekeningplots fan selektearre ferskillend útdrukte genen of proteïnen tusken stadige en snelle fezels. D Ferrikingsanalyze fan signifikant ferskillend útdrukte transkripten en proteïnen. Oerlappende wearden binne ferrike yn beide datasets, transkriptoomwearden binne allinich ferrike yn it transkriptoom, en proteoomwearden binne allinich ferrike yn it proteoom. Statistyske analyze waard útfierd mei it clusterProfiler-pakket mei Benjamini-Hochberg oanpaste p-wearden. E. Transkripsjefaktoaren dy't spesifike binne foar it fezeltype identifisearre troch SCENIC op basis fan SCENIC-ôflaatte regulatorspesifisiteitsskoares en ferskillende mRNA-ekspresje tusken fezeltypen. F. Profilearring fan selektearre transkripsjefaktoaren dy't ferskillend útdrukt wurde tusken stadige en rappe fezels.
Wy hawwe doe in oerrepresintaasje-analyze útfierd fan ferskillend fertsjintwurdige genen en proteïnen (figuer 4D, oanfoljende dataset 13). Paadferriking foar funksjes dy't ferskille tusken de twa datasets liet ferwachte ferskillen sjen, lykas fetsoer β-oksidaasje en ketonmetabolismeprosessen (trage fezels), myofilament/spierkontraksje (respektyflik rappe en stadige fezels), en koalhydraatkatabolyske prosessen (snelle fezels). Serine/treonine proteïnefosfatase-aktiviteit wie ek ferhege yn rappe fezels, oandreaun troch funksjes lykas de regulatoryske en katalytyske fosfatase-subeenheden (PPP3CB, PPP1R3D, en PPP1R3A), dy't bekend binne om glykogeenmetabolisme te regeljen (47) (oanfoljende figuren 8D-E). Oare paden ferrike mei snelle fezels omfette ferwurkingslichems (P-) (YTHDF3, TRIM21, LSM2) yn it proteoom (Oanfoljende Fig. 8F), mooglik belutsen by post-transkripsjonele regeling (48), en transkripsjefaktoraktiviteit (SREBF1, RXRG, RORA) yn it transkriptoom (Oanfoljende Fig. 8G). Trage fezels waarden ferrike mei oksidoreduktaseaktiviteit (BDH1, DCXR, TXN2) (Oanfoljende Fig. 8H), amidebinding (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Oanfoljende Fig. 8I), ekstrasellulêre matrix (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Oanfoljende Fig. 8J), en reseptor-ligandaktiviteit (FNDC5, SPX, NENF) (Oanfoljende Fig. 8K).
Om fierder ynsjoch te krijen yn 'e transkripsjonele regeling dy't ûnderlizzend is oan 'e skaaimerken fan stadich/snelle spiervezels, hawwe wy transkripsjefaktorferrikingsanalyse útfierd mei SCENIC49 (Supplementary Data Set 14). In protte transkripsjefaktoren wiene signifikant ferrike tusken snelle en stadige spiervezels (figuer 4E). Dit omfette transkripsjefaktoren lykas MAFA, dy't earder keppele is oan rappe ûntwikkeling fan spiervezels,50, lykas ferskate transkripsjefaktoren dy't earder net assosjeare waarden mei spesifike genprogramma's foar spiervezels. Hjirûnder wiene PITX1, EGR1 en MYF6 de meast ferrike transkripsjefaktoren yn snelle spiervezels (figuer 4E). Yn tsjinstelling dêrmei wiene ZSCAN30 en EPAS1 (ek wol bekend as HIF2A) de meast ferrike transkripsjefaktoren yn stadige spiervezels (figuer 4E). Yn oerienstimming hjirmei waard MAFA op hegere nivo's útdrukt yn 'e UMAP-regio dy't oerienkomt mei snelle spiervezels, wylst EPAS1 it tsjinoerstelde ekspresjepatroan hie (figuer 4F).
Neist bekende proteïne-kodearjende genen binne der ferskate net-kodearjende RNA-biotypen dy't mooglik belutsen binne by de regeling fan minsklike ûntwikkeling en sykte. 51, 52 Yn transkriptoomdatasets litte ferskate net-kodearjende RNA's fezeltypespesifisiteit sjen (figuer 5A en oanfoljende dataset 15), ynklusyf LINC01405, dat tige spesifyk is foar stadige fezels en rapportearre wurdt as fermindere yn spieren fan pasjinten mei mitochondriale myopaty. 53 Yn tsjinstelling, RP11-255P5.3, oerienkommende mei it lnc-ERCC5-5-gen (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, lit rappe fezeltypespesifisiteit sjen. Sawol LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) as RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) litte skeletspierspesifisiteit sjen (Oanfoljende figueren 9A-B) en hawwe gjin bekende kontraktile genen binnen har 1 Mb genomyske buert, wat suggerearret dat se in spesjalisearre rol spylje yn it regeljen fan fezelsoarten ynstee fan it regeljen fan buorjende kontraktile genen. De stadige/snelle fezelsoarte-spesifike ekspresjeprofilen fan respektivelik LINC01405 en RP11-255P5.3 waarden befêstige mei RNAscope (figueren 5B-C).
A. Net-kodearjende RNA-transkripten wurde signifikant regele yn stadich- en fluch-trekkende spiervezels. B. Represintative RNAscope-ôfbyldings dy't de spesifisiteit fan it stadich- en fluch-trekkende fezeltype fan respektivelik LINC01405 en RP11-255P5.3 sjen litte. Skaalbalke = 50 μm. C. Kwantifikaasje fan myofibertypespesifike net-kodearjende RNA-ekspresje lykas bepaald troch RNAscope (n = 3 biopsies fan ûnôfhinklike yndividuen, wêrby't rappe en stadige spiervezels binnen elk yndividu fergelike wurde). Statistyske analyze waard útfierd mei in twasidige Student's t-test. Boxplots litte de mediaan en de earste en tredde kwartielen sjen, mei whiskers dy't nei de minimale en maksimale wearden wize. D. De novo workflow foar identifikaasje fan mikrobiële proteïne (makke mei BioRender.com). E. It mikrobiële proteïne LINC01405_ORF408:17441:17358 wurdt spesifyk útdrukt yn stadige skeletspiervezels (n=5 biopsies fan ûnôfhinklike dielnimmers, wêrby't rappe en stadige spiervezels yn elke dielnimmer fergelike wurde). Statistyske analyze waard útfierd mei de lineêre modelmetoade fan Limm yn kombinaasje mei in empiryske Bayesiaanske oanpak, folge troch de Benjamini-Hochberg-metoade foar meardere fergelikingen mei p-wearde-oanpassing. Boxplots litte de mediaan, earste en tredde kwartielen sjen, mei whiskers dy't nei de maksimum/minimum wearden wize.
Koartlyn hawwe stúdzjes oantoand dat in protte fertochte net-kodearjende transkripten kodearje foar transkribearre mikrobiële proteïnen, wêrfan guon spierfunksje regelje. 44, 55 Om mikrobiële proteïnen te identifisearjen mei potinsjele spesifisiteit fan it fezeltype, hawwe wy ús dataset fan 1000 fezels proteoom trochsocht mei in oanpast FASTA-bestân mei de sekwinsjes fan net-kodearjende transkripten (n = 305) fûn yn 'e dataset fan 1000 fezels transkriptomen (figuer 5D). Wy identifisearren 197 mikrobiële proteïnen út 22 ferskillende transkripten, wêrfan 71 ferskillend regele waarden tusken stadige en rappe skeletspiervezels (oanfoljende figuer 9C en oanfoljende dataset 16). Foar LINC01405 waarden trije mikrobiële proteïneprodukten identifisearre, wêrfan ien in ferlykbere spesifisiteit fan stadige fezels liet sjen as syn transkript (figuer 5E en oanfoljende figuer 9D). Sa identifisearren wy LINC01405 as in gen dat kodearret foar in mikrobiële proteïne spesifyk foar stadige skeletspiervezels.
Wy hawwe in wiidweidige workflow ûntwikkele foar grutskalige proteomyske karakterisaasje fan yndividuele spiervezels en identifisearren regulators fan fezelheterogeniteit yn sûne steaten. Wy hawwe dizze workflow tapast om te begripen hoe't nemaline myopatyen ynfloed hawwe op skeletspiervezelheterogeniteit. Nemaline myopatyen binne erflike spiersykten dy't spierswakte feroarsaakje en, by troffen bern, presintearje mei in ferskaat oan komplikaasjes, ynklusyf sykheljensproblemen, skoliose en beheinde ledemaatmobiliteit. 19,20 Typysk resultearje by nemaline myopatyen yn patogene farianten yn genen lykas aktine alfa 1 (ACTA1) yn in oerhearsking fan 'e myofiberkomposysje mei stadige spierspanning, hoewol dit effekt heterogeen is. Ien opmerklike útsûndering is troponine T1 nemaline myopaty (TNNT1), dy't in oerhearsking hat fan snelle fezels. Sa kin in better begryp fan 'e heterogeniteit dy't ûnderlizzend is oan' e dysregulaasje fan skeletspiervezels dy't waarnommen wurdt yn nemaline myopatyen helpe om de komplekse relaasje tusken dizze sykten en it myofibertype te ûntrafeljen.
Yn ferliking mei sûne kontrôles (n=3 per groep) lieten myofibers isolearre fan pasjinten mei nemaline myopaty mei mutaasjes yn 'e ACTA1- en TNNT1-genen in dúdlike myofiberatrofy of dystrofy sjen (figuer 6A, oanfoljende tabel 3). Dit presintearre wichtige technyske útdagings foar proteomyske analyze fanwegen de beheinde hoemannichte beskikber materiaal. Nettsjinsteande dit koene wy 2485 proteïnen yn 272 skeletale myofibers detektearje. Nei it filterjen fan teminsten 1000 kwantifisearre proteïnen per fezels waarden 250 fezels ûnderwurpen oan in folgjende bioinformatyske analyze. Nei it filterjen waarden in gemiddelde fan 1573 ± 359 proteïnen per fezels kwantifisearre (oanfoljende figuer 10A, oanfoljende datasets 17–18). It is opmerklik dat, nettsjinsteande de wichtige fermindering fan fezelgrutte, de proteoomdjipte fan pasjintmonsters mei nemaline myopaty mar beskieden fermindere waard. Boppedat hawwe wy troch it ferwurkjen fan dizze gegevens mei ús eigen FASTA-bestannen (ynklusyf net-kodearjende transkripten) fiif mikrobiële proteïnen yn skeletmyofibers fan pasjinten mei nemaline myopaty identifisearre (Oanfoljende dataset 19). It dynamyske berik fan it proteoom wie signifikant breder, en totale proteïnen yn 'e kontrôlegroep korrelearren goed mei de resultaten fan in eardere proteoomanalyse fan 1000 fezels (Oanfoljende fig. 10B-C).
A. Mikroskopyske ôfbyldings dy't fezelatrofie of dystrofie sjen litte en de oerhearsking fan ferskate fezeltypen basearre op MYH yn ACTA1- en TNNT1 nemaline myopathyen (NM). Skaalbalke = 100 μm. Om de reprodusearberens fan kleuring te garandearjen yn ACTA1- en TNNT1-pasjinten, waarden trije pasjintbiopsieën twa oant trije kear kleurd (fjouwer seksjes per gefal) foardat represintative ôfbyldings selektearre waarden. B. Fezeltype-ferhâldingen yn dielnimmers basearre op MYH. C. Haadkomponintanalyze (PCA) plot fan skeletspiervezels by pasjinten mei nemaline myopathyen en kontrôles. D. Skeletspiervezels fan pasjinten mei nemaline myopathyen en kontrôles projeksjeare op in PCA-plot bepaald út 'e 1000 fezels analysearre yn Figuer 2. Bygelyks, fulkaanplots dy't ferskillen fergelykje tusken dielnimmers mei ACTA1- en TNNT1 nemaline myopathyen en kontrôles, en tusken dielnimmers mei ACTA1- en TNNT1 nemaline myopathyen. Kleurde sirkels jouwe proteïnen oan dy't signifikant oars wiene by π < 0.05, en donkere stippen jouwe proteïnen oan dy't signifikant oars wiene by FDR < 0.05. Statistyske analyze waard útfierd mei de Limma lineêre modelmetoade en empiryske Bayesiaanske metoaden, folge troch p-wearde-oanpassing foar meardere fergelikingen mei de Benjamini-Hochberg-metoade. H. Ferrikingsanalyze fan signifikant ferskillend útdrukte proteïnen oer it heule proteoom en yn type 1- en 2A-vezels. Statistyske analyze waard útfierd mei it clusterProfiler-pakket en Benjamini-Hochberg-oanpaste p-wearden. I, J. Haadkomponintanalyze (PCA) plots kleurd troch ekstrasellulêre matrix en mitochondriale genontology (GO) termen.
Omdat nemaline myopathies ynfloed kinne hawwe op it oandiel fan MYH-ekspressearjende myofibertypen yn skeletspieren,19,20 hawwe wy earst de MYH-ekspressearjende myofibertypen ûndersocht by pasjinten mei nemaline myopathies en kontrôles. Wy hawwe it myofibertype bepaald mei in ûnpartidige metoade dy't earder beskreaun is foar de 1000 myofiber-assay (Oanfoljende Figs. 10D-E) en slaggen der wer net yn om suvere 2X myofibers te identifisearjen (Ofbylding 6B). Wy seagen in heterogeen effekt fan nemaline myopathies op it myofibertype, om't twa pasjinten mei ACTA1-mutaasjes in ferhege oandiel fan type 1 myofibers hienen, wylst twa pasjinten mei TNNT1 nemaline myopaty in fermindere oandiel fan type 1 myofibers hienen (Ofbylding 6B). Yndied, de ekspresje fan MYH2 en snelle troponine-isoformen (TNNC2, TNNI2, en TNNT3) wie fermindere yn ACTA1-nemaline myopathies, wylst MYH7-ekspresje fermindere wie yn TNNT1-nemaline myopathies (Oanfoljende Figuer 11A). Dit komt oerien mei eardere rapporten fan heterogene myofibertypewikseling yn nemaline myopathies.19,20 Wy hawwe dizze resultaten befêstige troch immunohistochemy en fûnen dat pasjinten mei ACTA1-nemaline myopaty in oerhearsking fan type 1 myofibers hiene, wylst pasjinten mei TNNT1-nemaline myopaty it tsjinoerstelde patroan hiene (Figuer 6A).
Op it nivo fan ienfaserproteoom klusteren skeletspiervezels fan pasjinten mei ACTA1- en TNNT1 nemaline myopaty mei de mearderheid fan 'e kontrôlevezels, wêrby't TNNT1 nemaline myopatyvezels oer it algemien it swierst beynfloede waarden (figuer 6C). Dit wie foaral dúdlik by it plotten fan haadkomponintanalyse (PCA) plots fan pseudo-opblaasde fezels foar elke pasjint, wêrby't TNNT1 nemaline myopatypasjinten 2 en 3 it fierst fan 'e kontrôlemonsters ôf kamen (Oanfoljende figuer 11B, Oanfoljende dataset 20). Om better te begripen hoe't fezels fan myopatypasjinten fergelykje mei sûne fezels, hawwe wy detaillearre ynformaasje brûkt dy't wy krigen hawwe út proteomyske analyze fan 1.000 fezels fan sûne folwoeksen dielnimmers. Wy projektearren fezels út 'e myopatydataset (ACTA1- en TNNT1 nemaline myopatypasjinten en kontrôles) op 'e PCA-plot dy't wy krigen hawwe út 'e proteomyske analyze fan 1000 fezels (figuer 6D). De ferdieling fan MYH-fezeltypen lâns PC2 yn kontrôlevezels wie fergelykber mei de fezelferdieling dy't krigen is út 'e proteomyske analyze fan 1000 fezels. De measte fezels by pasjinten mei nemaline myopaty ferskowen lykwols nei ûnderen nei PC2, en oerlappen mei sûne fezels mei snelle trek, nettsjinsteande har native MYH-fezeltype. Dus, hoewol pasjinten mei ACTA1 nemaline myopaty in ferskowing lieten sjen nei type 1-fezels doe't kwantifisearre mei MYH-basearre metoaden, ferskowen sawol ACTA1 nemaline myopaty as TNNT1 nemaline myopaty it skeletspierfezelproteoom nei fezels mei snelle trek.
Wy hawwe doe elke pasjintgroep direkt fergelike mei sûne kontrôles en identifisearre 256 en 552 ferskillend útdrukte proteïnen yn ACTA1- en TNNT1 nemaline myopathyen, respektivelik (figuer 6E–G en oanfoljende figuer 11C, oanfoljende dataset 21). Genferrikingsanalyse liet in koördinearre ôfname yn mitochondriale proteïnen sjen (figuer 6H–I, oanfoljende dataset 22). Ferrassend genôch, nettsjinsteande de ferskillende oerhearsking fan fezeltypen yn ACTA1- en TNNT1 nemaline myopathyen, wie dizze ôfname folslein ûnôfhinklik fan it op MYH basearre fezeltype (figuer 6H en oanfoljende figueren 11D–I, oanfoljende dataset 23). Trije mikrobiële proteïnen waarden ek regele yn ACTA1- of TNNT1 nemaline myopathyen. Twa fan dizze mikroproteïnen, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (ek wol bekend as LINC00598 of Lnc-FOXO1) en ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), lieten allinich ferskillende oerfloed sjen yn type 1 myofibers. Earder is rapportearre dat ENSG00000215483_TR14_ORF67 in rol spilet yn 'e selsyklusregeling. 56 Oan 'e oare kant wie ENSG00000232046_TR1_ORF437 (oerienkommende mei LINC01798) ferhege yn sawol type 1 as type 2A myofibers yn ACTA1-nemaline myopaty yn ferliking mei sûne kontrôles (Oanfoljende figuer 12A, Oanfoljende dataset 24). Yn tsjinstelling, waarden ribosomale proteïnen foar in grut part net beynfloede troch nemaline myopaty, hoewol RPS17 delregulearre wie yn ACTA1 nemaline myopaty (Fig. 6E).
Ferrikingsanalyse liet ek opregulearring fan ymmúnsysteemprosessen sjen yn ACTA1- en TNNT1-nemaline myopathyen, wylst seladhesie ek ferhege wie yn TNNT1-nemaline myopaty (figuer 6H). De ferriking fan dizze ekstrasellulêre faktoaren waard wjerspegele troch de ekstrasellulêre matrixproteinen dy't PCA yn PC1 en PC2 yn in negative rjochting ferskowe (d.w.s. nei de meast troffen fezels) (figuer 6J). Beide pasjintgroepen lieten ferhege ekspresje sjen fan ekstrasellulêre proteinen dy't belutsen binne by ymmúnreaksjes en sarkolemmale reparaasjemeganismen, lykas annexinen (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 en har ynteraksjeprotein S100A1159 (Oanfoljende figuren 12B-C). Dit proses is earder rapportearre as fersterke yn spierdystrofyen60, mar, foar safier't wy witte, is it earder net assosjeare mei nemaline myopathyen. Normale funksje fan dizze molekulêre masinery is fereaske foar sarkolemmale reparaasje nei ferwûning en foar de fúzje fan nij foarme myocyten mei myofibers58,61. Sa suggerearret de ferhege aktiviteit fan dit proses yn beide pasjintgroepen in reparative reaksje op ferwûning feroarsake troch myofiber-ynstabiliteit.
De effekten fan elke nemaline myopaty wiene goed korrelearre (r = 0.736) en lieten ridlike oerlaap sjen (Oanfoljende Figuren 11A-B), wat oanjout dat ACTA1 en TNNT1 nemaline myopaty ferlykbere effekten hawwe op it proteoom. Guon proteïnen waarden lykwols allinich regele yn ACTA1 of TNNT1 nemaline myopaty (Oanfoljende Figuren 11A en C). It profibrotyske proteïne MFAP4 wie ien fan 'e meast opregulearre proteïnen yn TNNT1 nemaline myopaty, mar bleau net feroare yn ACTA1 nemaline myopaty. SKIC8, in komponint fan it PAF1C-kompleks ferantwurdlik foar it regeljen fan HOX-gentranskripsje, wie delregulearre yn TNNT1 nemaline myopaty, mar net beynfloede yn ACTA1 nemaline myopaty (Oanfoljende Figure 11A). Direkte ferliking fan ACTA1- en TNNT1-nemaline-myopaty liet gruttere ferminderingen yn mitochondriale proteïnen en ferhegingen fan ymmúnsysteemproteïnen sjen yn TNNT1-nemaline-myopaty (figuer 6G–H en oanfoljende figuren 11C en 11H–I). Dizze gegevens binne yn oerienstimming mei de gruttere atrofy/dystrofy dy't waarnommen is yn TNNT1-nemaline-myopaty yn ferliking mei TNNT1-nemaline-myopaty (figuer 6A), wat suggerearret dat TNNT1-nemaline-myopaty in earnstiger foarm fan 'e sykte fertsjintwurdiget.
Om te beoardieljen oft de waarnommen effekten fan nemaline myopaty op it nivo fan 'e hiele spier oanhâlde, hawwe wy in bulkproteomyske analyze útfierd fan spierbiopsies fan deselde kohort fan TNNT1 nemaline myopaty-pasjinten en se fergelike mei kontrôles (n=3 per groep) (Oanfoljende Fig. 13A, Oanfoljende Dataset 25). Lykas ferwachte wiene kontrôles nau besibbe yn haadkomponintanalyze, wylst TNNT1 nemaline myopaty-pasjinten in hegere yntersample-fariabiliteit sjen lieten, fergelykber mei dy sjoen yn ienfaseranalyze (Oanfoljende Fig. 13B). Bulkanalyze reprodusearre de ferskillend útdrukte proteïnen (Oanfoljende Fig. 13C, Oanfoljende Dataset 26) en biologyske prosessen (Oanfoljende Fig. 13D, Oanfoljende Dataset 27) dy't markearre waarden troch it fergelykjen fan yndividuele fezels, mar ferlearen it fermogen om ûnderskied te meitsjen tusken ferskate fezeltypen en koene gjin rekken hâlde mei heterogene sykte-effekten oer fezels.
Mei-inoar litte dizze gegevens sjen dat proteomika fan ien myofiber klinyske biologyske skaaimerken ferdúdlikje kin dy't net te detektearjen binne mei rjochte metoaden lykas immunoblotting. Boppedat markearje dizze gegevens de beheiningen fan it brûken fan allinich aktinefibertypering (MYH) om fenotypyske oanpassing te beskriuwen. Yndied, hoewol it wikseljen fan fibertype ferskilt tusken aktine- en troponine nemaline myopathyen, ûntkoppelje beide nemaline myopathyen MYH-fibertypering fan skeletspierfibermetabolisme nei in rapper en minder oksidatyf spierproteoom.
Sellulêre heterogeniteit is kritysk foar weefsels om oan harren ferskate easken te foldwaan. Yn skeletspieren wurdt dit faak omskreaun as fezeltypen dy't karakterisearre wurde troch ferskillende graden fan krêftproduksje en wurgens. It is lykwols dúdlik dat dit mar in lyts part fan 'e fariabiliteit fan skeletspiervezels ferklearret, dy't folle fariabeler, komplekser en mearfasettiger is as earder tocht. Technologyske foarútgong hat no ljocht smiten op 'e faktoaren dy't skeletspiervezels regelje. Yndied, ús gegevens suggerearje dat type 2X-fezels miskien gjin apart subtype fan skeletspiervezels binne. Boppedat hawwe wy metabolike aaiwiten, ribosomale aaiwiten en sel-assosjeare aaiwiten identifisearre as wichtige determinanten fan heterogeniteit fan skeletspiervezels. Troch ús proteomyske workflow ta te passen op pasjintmonsters mei nematodemyopaty, hawwe wy fierder oantoand dat MYH-basearre fezeltypering de heterogeniteit fan skeletspieren net folslein reflektearret, foaral as it systeem fersteurd is. Yndied, nettsjinsteande it MYH-basearre fezeltype, resultearret nematodemyopaty yn in ferskowing nei rapper en minder oksidative fezels.
Skeletspiervezels wurde sûnt de 19e iuw klassifisearre. Resinte omics-analyses hawwe ús tastien om de ekspresjeprofilen fan ferskate MYH-vezeltypen en har reaksjes op ferskate stimuli te begripen. Lykas hjir beskreaun, hawwe omics-oanpakken ek it foardiel fan gruttere gefoelichheid foar it kwantifisearjen fan fezeltypemarkers dan tradisjonele metoaden basearre op antistoffen, sûnder te fertrouwen op 'e kwantifikaasje fan ien (of in pear) markers om in skeletspiervezeltype te definiearjen. Wy brûkten komplementêre transkriptomyske en proteomyske workflows en yntegrearren de resultaten om de transkripsjonele en post-transkripsjonele regeling fan fezelheterogeniteit yn minsklike skeletspiervezels te ûndersiikjen. Dizze workflow resultearre yn it mislearjen om suvere 2X-type fezels op proteïnenivo te identifisearjen yn 'e vastus lateralis fan ús kohort fan sûne jonge manlju. Dit komt oerien mei eardere stúdzjes mei ien fezel dy't <1% suvere 2X-fezels fûnen yn sûne vastus lateralis, hoewol dit yn 'e takomst yn oare spieren befêstige wurde moat. De diskrepânsje tusken de deteksje fan hast suvere 2X-fezels op mRNA-nivo en allinich mingde 2A/2X-fezels op proteïnenivo is fernuverejend. MYH-isoform mRNA-ekspresje is net sirkadiaal,67 wat suggerearret dat wy it MYH2-oansetsignaal wierskynlik net "mist" hawwe yn skynber suvere 2X-vezels op RNA-nivo. Ien mooglike ferklearring, hoewol suver hypotetysk, koe ferskillen wêze yn proteïne- en/of mRNA-stabiliteit tusken MYH-isoformen. Yndied, gjin snelle fezels binne 100% suver foar hokker MYH-isoform dan ek, en it is ûndúdlik oft MYH1 mRNA-ekspresjenivo's yn it berik fan 70-90% soene resultearje yn gelikense MYH1- en MYH2-oerfloed op proteïnenivo. By it beskôgjen fan it heule transkriptoom of proteoom kin klusteranalyse lykwols mei fertrouwen mar twa ûnderskate klusters identifisearje dy't stadige en rappe skeletspiervezels fertsjintwurdigje, nettsjinsteande har krekte MYH-gearstalling. Dit komt oerien mei analyses mei single-nucleus transkriptomyske oanpakken, dy't typysk mar twa ûnderskate myonukleêre klusters identifisearje. 68, 69, 70 Fierder, hoewol eardere proteomyske stúdzjes type 2X-fezels hawwe identifisearre, klusterje dizze fezels net apart fan 'e rest fan' e snelle fezels en litte se mar in lyts oantal ferskillend oerfloedige proteïnen sjen yn ferliking mei oare fezeltypen basearre op MYH. 14 Dizze resultaten suggerearje dat wy werom moatte nei de iere 20e-ieuske werjefte fan spierfezelklassifikaasje, dy't minsklike skeletspierfezels net ferdielde yn trije ûnderskate klassen basearre op MYH, mar yn twa klusters basearre op har metabolike en kontraktile eigenskippen. 63
Wichtiger is dat myofiber-heterogeniteit beskôge wurde moat lâns meardere diminsjes. Eardere "omics"-stúdzjes hawwe yn dizze rjochting wiisd, en suggerearje dat skeletspiervezels gjin aparte klusters foarmje, mar lâns in kontinuüm regele binne. 11, 13, 14, 64, 71 Hjir litte wy sjen dat, neist ferskillen yn kontraktile en metabolike eigenskippen fan skeletspieren, myofibers ûnderskieden wurde kinne troch funksjes dy't relatearre binne oan sel-sel-ynteraksjes en oersettingsmeganismen. Yndied, wy fûnen ribosoom-heterogeniteit yn skeletspiervezels dy't bydraacht oan heterogeniteit ûnôfhinklik fan stadige en snelle fezeltypen. De ûnderlizzende oarsaak fan dizze substansjele myofiber-heterogeniteit, ûnôfhinklik fan stadige en snelle fezeltype, bliuwt ûndúdlik, mar it kin wize op spesjalisearre romtlike organisaasje binnen spierfassikels dy't optimaal reagearje op spesifike krêften en lesten, 72 spesjalisearre sellulêre of oargelspesifike kommunikaasje mei oare seltypen yn 'e spiermikroomjouwing 73,74,75 of ferskillen yn ribosoomaktiviteit binnen yndividuele myofibers. Yndied, ribosomale heteroplasmy, of troch paraloge substituasje fan RPL3 en RPL3L of op it nivo fan 2'O-metylaasje fan rRNA, is oantoand te wêzen assosjeare mei skeletspierhypertrofy76,77. Multi-omyske en romtlike tapassingen yn kombinaasje mei funksjonele karakterisaasje fan yndividuele myofibers sille ús begryp fan spierbiology op it multi-omyske nivo fierder ferbetterje78.
Troch it analysearjen fan 'e proteomen fan ienkele myofibers fan pasjinten mei nemaline myopathyen, hawwe wy ek it nut, de effektiviteit en de tapassing fan ienkele myofiber proteomics oantoand om de klinyske patofysiology fan skeletspieren te ferdúdlikjen. Boppedat, troch ús workflow te fergelykjen mei globale proteomika-analyze, koene wy oantoane dat ienkele myofiber proteomics deselde djipte fan ynformaasje oplevert as globale weefselproteomics en dizze djipte útwreidet troch rekken te hâlden mei ynterfiber heterogeniteit en myofibertype. Neist de ferwachte (alhoewol fariabele) ferskillen yn fezeltypeferhâlding dy't waarnommen binne yn ACTA1- en TNNT1 nemaline myopathyen yn ferliking mei sûne kontrôles,19 hawwe wy ek oksidative en ekstrasellulêre remodeling observearre ûnôfhinklik fan MYH-mediatearre fezeltypewikseling. Fibrose is earder rapportearre yn TNNT1 nemaline myopathyen.19 Us analyze bout lykwols fierder op dizze fynst troch ek ferhege nivo's fan ekstrasellulêre útskieden stress-relatearre proteïnen, lykas annexinen, belutsen by sarkolemmale reparaasjemeganismen, te iepenbierjen yn myofibers fan pasjinten mei ACTA1- en TNNT1 nemaline myopathyen.57,58,59 Konklúzjend kinne ferhege annexinenivo's yn myofibers fan pasjinten mei nemaline myopaty in sellulêre reaksje op it reparearjen fan slim atrofyske myofibers fertsjintwurdigje.
Hoewol dizze stúdzje oant no ta de grutste single-fiber whole-muscle-omics-analyze fan minsken fertsjintwurdiget, is it net sûnder beheiningen. Wy isolearren skeletspiervezels út in relatyf lytse en homogene stekproef fan dielnimmers en ien spier (de vastus lateralis). Dêrom is it ûnmooglik om it bestean fan spesifike fezelpopulaasjes oer spiertypen en oan ekstremen fan spierfysiology út te sluten. Bygelyks, wy kinne de mooglikheid net útslute dat in subset fan ultrasnelle fezels (bygelyks, suvere 2X-fezels) ûntstiet by heechoplate sprinters en/of krêftatleten79 of tidens perioaden fan spierynaktiviteit66,80. Fierder foarkaam de beheinde stekproefgrutte fan dielnimmers ús om geslachtsferskillen yn fezelheterogeniteit te ûndersykjen, om't bekend is dat fezeltypeferhâldingen ferskille tusken manlju en froulju. Fierder koene wy gjin transkriptomyske en proteomyske analyses útfiere op deselde spiervezels of stekproeven fan deselde dielnimmers. Wylst wy en oaren trochgean mei it optimalisearjen fan analyses fan ien sel en ien myofiber mei omics-analyze om ultra-lege stekproefynfier te berikken (lykas hjir oantoand yn 'e analyze fan fezels fan pasjinten mei mitochondriale myopaty), wurdt de kâns om multi-omics (en funksjonele) oanpakken te kombinearjen binnen ienige spiervezels dúdlik.
Oer it algemien identifisearje en ferklearje ús gegevens transkripsjonele en post-transkripsjonele driuwfearren fan skeletspierheterogeniteit. Spesifyk presintearje wy gegevens dy't in lang besteand dogma yn skeletspierfysiology yn 'e fraach stelle dat ferbûn is mei de klassike MYH-basearre definysje fan fezelsoarten. Wy hoopje it debat te fernijen en úteinlik ús begryp fan skeletspierfezelklassifikaasje en heterogeniteit opnij te betinken.
Fjirtjin blanke dielnimmers (12 manlju en 2 froulju) hawwe frijwillich ynstimd mei dielname oan dizze stúdzje. De stúdzje waard goedkard troch de Etyske Kommisje fan it Universitêr Sikehûs fan Gent (BC-10237), foldie oan de Helsinki-ferklearring fan 2013, en waard registrearre by ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Algemiene skaaimerken fan 'e dielnimmers wurde presintearre yn Oanfoljende Tabel 1. Nei it krijen fan mûnlinge en skriftlike ynformearre tastimming ûndergien dielnimmers in medysk ûndersyk foardat se definitive opname yn 'e stúdzje ûndergien waarden. Dielnimmers wiene jong (22-42 jier), sûn (gjin medyske omstannichheden, gjin smokeskiednis) en matich fysyk aktyf. Maksimale soerstofopname waard bepaald mei in stap-ergometer foar it beoardieljen fan fysike fitheid lykas earder beskreaun. 81
Spierbiopsie-samples waarden trije kear sammele yn rêst en yn 'e fêste-tastân, 14 dagen útinoar. Omdat dizze samples waarden sammele as ûnderdiel fan in gruttere stúdzje, konsumearren dielnimmers placebo (laktose), in H1-reseptor-antagonist (540 mg fexofenadine), of in H2-reseptor-antagonist (40 mg famotidine) 40 minuten foar de biopsie. Wy hawwe earder oantoand dat dizze histamine-reseptor-antagonisten gjin ynfloed hawwe op 'e rêstende skeletspierfitness81, en gjin steat-relatearre klustering waard waarnommen yn ús kwaliteitskontrôleplots (Oanfoljende figueren 3 en 6). In standerdisearre dieet (41,4 kcal/kg lichemsgewicht, 5,1 g/kg lichemsgewicht koalhydraten, 1,4 g/kg lichemsgewicht proteïne, en 1,6 g/kg lichemsgewicht fet) waard 48 oeren foar elke eksperimintele dei oanhâlden, en in standerdisearre moarnsbrochje (1,5 g/kg lichemsgewicht koalhydraten) waard moarns op 'e eksperimintele dei konsumearre. Under lokale anaesthesia (0,5 ml 1% lidokaïne sûnder epinefrine) waarden spierbiopsieën nommen fan 'e vastus lateralis-spier mei perkutane Bergström-aspiraasje.82 Spiermonsters waarden fuortendaliks ynbêde yn RNAlater en opslein by 4 °C oant manuele fezeldisseksje (oant 3 dagen).
Farsk isolearre myofiberbondels waarden oerdroegen nei farsk RNAlater-medium yn in kweekskûtel. Yndividuele myofibers waarden doe mei de hân dissekearre mei in stereomikroskoop en in fyn pinset. Fiifentweintich fezels waarden út elke biopsie dissekearre, mei spesjale oandacht foar it selektearjen fan fezels út ferskate gebieten fan 'e biopsie. Nei disseksje waard elke fezel foarsichtich ûnderdompele yn 3 μl lysisbuffer (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) mei proteinase K en DNase-enzymen om net winske proteïnen en DNA te ferwiderjen. Sellysis en proteïne/DNA-ferwidering waarden doe inisjeare troch koart vortexen, it draaien fan 'e floeistof yn in mikrosentrifuge, en ynkubaasje by keamertemperatuer (10 min). It lysaat waard doe ynkubearre yn in termyske cycler (T100, Bio-Rad) by 37 °C foar 5 minuten, 75 °C foar 5 minuten, en doe fuortendaliks opslein by -80 °C oant fierdere ferwurking.
Illumina-kompatible polyadenylearre RNA-bibleteken waarden taret út 2 µl myofiberlysaat mei de QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen). Detaillearre metoaden binne te finen yn 'e hantlieding fan' e fabrikant. It proses begjint mei earste-string cDNA-synteze troch reverse transkripsje, wêrby't unike molekulêre identifisearders (UMI's) en stekproefspesifike i1-barcodes wurde yntrodusearre om pooling fan stekproeven te garandearjen en technyske fariabiliteit te ferminderjen tidens downstream-ferwurking. cDNA fan 96 myofibers wurdt dan pooled en suvere mei magnetyske kralen, wêrnei't RNA wurdt fuorthelle en twadde-string-synteze wurdt útfierd mei willekeurige primers. De bibleteek wurdt suvere mei magnetyske kralen, pool-spesifike i5/i7-tags wurde tafoege, en PCR wurdt amplifisearre. In lêste suveringsstap produseart Illumina-kompatible bibleteken. De kwaliteit fan elke bibleteekpool waard beoardiele mei de High Sensitivity Small Fragment DNA Analysis Kit (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Op basis fan Qubit-kwantifikaasje waarden pools fierder poold by lykmolêre konsintraasjes (2 nM). De resultearjende pool waard doe sekwinsjearre op in NovaSeq 6000-ynstrumint yn standertmodus mei de NovaSeq S2 Reagent Kit (1 × 100 nukleotiden) mei 2 nM lading (4% PhiX).
Us pipeline is basearre op Lexogen's QuantSeq Pool data-analyse pipeline (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Data waarden earst demultipleksearre mei bcl2fastq2 (v2.20.0) basearre op de i7/i5 yndeks. Read 2 waard doe demultipleksearre mei idemux (v0.1.6) basearre op de i1 sample barcode en UMI-sekwinsjes waarden ekstrahearre mei umi_tools (v1.0.1). Reads waarden doe yn meardere rûndes mei cutadapt (v3.4) trimme om koarte reads (<20 yn lingte) of reads dy't allinich út adaptersekwinsjes besteane te ferwiderjen. Reads waarden doe ôfstimd op it minsklik genoom mei STAR (v2.6.0c) en BAM-bestannen waarden yndeksearre mei SAMtools (v1.11). Duplikaat reads waarden fuorthelle mei umi_tools (v1.0.1). Uteinlik waard ôfstimmingstelling útfierd mei featureCounts yn Subread (v2.0.3). Kwaliteitskontrôle waard útfierd mei FastQC (v0.11.9) op ferskate tuskenstadia fan 'e pipeline.
Alle fierdere bioinformatyske ferwurking en fisualisaasje waarden útfierd yn R (v4.2.3), benammen mei de Seurat (v4.4.0) workflow. 83 Dêrom waarden yndividuele UMI-wearden en metadata-matrices omfoarme ta Seurat-objekten. Genen dy't útdrukt waarden yn minder as 30% fan alle fezels waarden fuorthelle. Samples fan lege kwaliteit waarden fuorthelle op basis fan in minimale drompel fan 1000 UMI-wearden en 1000 detektearre genen. Uteinlik hawwe 925 fezels alle stappen foar kwaliteitskontrôlefiltering trochjûn. UMI-wearden waarden normalisearre mei de Seurat SCTransform v2-metoade, 84 ynklusyf alle 7418 detektearre funksjes, en ferskillen tusken dielnimmers waarden fuorthelle. Alle relevante metadata binne te finen yn Supplementary Dataset 28.
Pleatsingstiid: 10 septimber 2025